PerfectProbe-Sonde fü Echtzeit-PCR qPCR

	PerfectProbe
	Eine verbesserte Sonde für Echtzeit-PCR Anwendungen
Eigenschaften von PerfectProbe (orange) im Vergleich zu TaqMan (blau) Empfindlicherer Nachweis (frühere CT-Werte) Bessere Reproduzierbarkeit (insbesondere nahe an der Nachweisgrenze) Verbesserte Fluoreszenz im Vergleich zu TaqMan und Molecular Beacon Höherer Signal-Rausch-Abstand als TaqMan Kundenspezifische Echtzeit-PCR Assays mit PerfectProbe-Sonden sind auf Anfrage für alle menschlichen Gene und Maus- oder Rattengene erhältlich. Fig.1 — Test der Primer für das menschliche YWHAZ Gen mit PerfectProbe (orange) und TaqMan-Sonden (blau)

Was sagen unsere Kunden ? "....The PerfectProbe technology has greatly improved both replicate reproducibility and the quality of the traces. After working with PerfectProbes I wouldn’t go back to using TaqMan Probes...."Dr C Boxall. Synairgen Research Plc. Forschungsunternehmen im Pharmabereich, Vereinigtes Königreich. Wie funktioniert die PerfectProbe-Sonde? Welches sind die Eigenschaften der perfekten Sonde für Echtzeit-PCR Anwendungen? Wichtig sind vor allem eine optimale Fluoreszenzlöschung (Quenching) und gleichzeitig eine hervorragende Fluoreszenz. Die Haarnadelstruktur von Molecular Beacon Sonden ermöglicht eine sehr wirksame Fluoreszenzlöschung, allerdings wird die Sonde nicht gespalten und erzeugt daher nur ein schwaches Leuchtsignal. Im Gegensatz zum Molecular Beacon wird die TaqMan-Sonde zwar gespalten, erzeugt aber aufgrund des großen räumlichen Abstands zwischen Fluorophor und Quencher ein hohes Hintergrundsignal. Die perfekte Sonde für Echtzeit-PCR Anwendungen muss die positiven Eigenschaften beider Sonden miteinander vereinen. Ihre Sekundärstruktur müsste den Abstand zwischen Quencher und Fluorophore minimieren, um die Hintergrundfluoreszenz zu verringern. Außerdem müsste sie über die gleiche ausgezeichnete Fluoreszenzeigenschaft verfügen wie eine Hydrolyse-Sonde (Fig.1). PrimerDesign hat eine Sonde entwickelt und validiert, die auf diesem Konzept basiert. Das Ergebnis ist eine Sonde mit einem optimierten Signal-Rausch-Abstand für den frühestmöglichen Nachweis von der Amplifikationsreaktion. Wir nennen unsere Entwicklung PerfectProbe.
	Vor der Amplifikation	Hybridisierung	Nach Extension
TaqMan
Molecular Beacon
PerfectProbe
Die Fluoreszenz wird während dieser Phase gemessen Beispieldaten* Fig 2a — Versuch mit unterschiedlichen Sonden und jeweils den gleichen Forward- und Reverse-Primern für AAA1 (Asthma-associated alternatively spliced gene 1). TaqMan und PerfectProbe nutzen dieselbe Annealingsequenz. Die Sequenz für den Molecular Beacon war kürzer, aber innerhalb der gleichen Zielregion. In Übereinstimmung mit dem obenstehenden Diagramm war die Hintergrundfluoreszenz für PerfectProbe mit der des Molecular Beacon vergleichbar, während der Endpunkt der Kurve mit dem von TaqMan vergleichbar ist. Fig.2a — AAA1(Asthma-associated alternatively spliced gene 1) - Basisdaten

Fig.2b — Mit dem iCycler ist eine einfache Grundliniensubtraktion möglich AAA1(Asthma-associated alternatively spliced gene 1) -Modifizierte Daten, Lineargrafik

Fig.3 — Relative Quantifizierung auf unterschiedlicher Hardware

iCycer IQ5 (BioRad)		LightCycler (Roche)	Rotorgene (Corbet/Qiagen)
Mit den oben genannten Assays wurde auf verschiedenen Plattformen eine relative Quantifizierung durchgeführt. Im Allgemeinen waren die PerfectProbe-Sonden 3 bis 5 Mal empfindlicher. Der Rotorgene nimmt eine Sonderstellung ein, da er für die Erstellung der Amplifikationskurven den Signal-Rausch-Abstand nutzt. Sonden mit einer niedrigen Hintergrundfluoreszenz sind auf diesem System also wesentlich empfindlicher als TaqMan-Sonden.